▲第一作者：Tomohiro Watanabe，OLIVIA PFEIL-GARDINER通讯作者：Seigo Shima，Bonnie J. Murphy通讯单位：马克斯普朗克陆地微生物研究所，马克斯普朗克生物物理研究所DOI：10.1126/science.abg5550研究背景甲烷是一种主要由产甲烷古菌产生的强效温室气体。在氢营养型甲烷载体中，甲烷被还原和呋喃形成甲酰基-甲烷呋喃。这些反应由含钼的甲酰甲烷呋喃脱氢酶 FmdABCDFG 或其钨同工型（tungsten isoform）FwdABCDFG催化。另一方面，来自二氧化碳 (CO2) 的产甲烷途径的第一个反应是在甲酰-甲烷呋喃脱氢酶 (Fmd) 的催化下，将 CO2 还原和缩合为甲酰-甲烷呋喃。该反应的强还原电子是由杂二硫化物还原酶 (Hdr) 与氢化酶或甲酸脱氢酶 (Fdh) 结合基于黄素的电子分叉机制产生的。研究问题本文报告了来自 Methanospirillum Hungatei 的 Fdh-Hdr-Fmd 复合物酶及其结构特征。复合物使用来自甲酸盐的电子和电子载体 F420 的还原形式催化该反应。HdrA 中的构象变化介导了分叉电子，而聚铁氧还蛋白 FmdF 直接将电子转移到 CO2 还原位点，即使没有游离铁氧还蛋白（Hdr 和 Fmd 之间的可扩散电子载体），依赖甲烷呋喃的基于黄素的电子分叉也证明了这一点。Hdr 和 Fmd 结构的保守性表明这种复合物在氢营养型产甲烷菌中很常见。图文分析▲图 1. M. Hungatei 酶复合物的纯化和表征。要点：● 本文通过三个层析步骤纯化了一个催化Hdr、Fdh和Fmd反应的酶复合物，以及通过四个层析步骤从Hungatei分枝杆菌细胞中纯化了显示HDR和FDH活性的亚复合物(图1)。本文还测定了Fdh-Hdr-Fmd和Fdh-Hdr复合物的酶活性和分子性质(图1D到F)。●质谱(MS)显示，Fdh-Hdr-Fmd复合物主要以FdhAB-MvhD-HdrABC-FmdABCDFG亚基的1-MDA二聚体的形式从SEC洗脱出来(图1B)。Fdh-Hdr配合物被分离为两个低聚态，分别含有FdhAB-MvhD-HdrABC-FmdF(图1C)。另一方面，本文还在所有复合物中检测到五种FdhA和FdhB同工酶中的两种。▲图 2. 二聚体（左）和六聚体（右）Fdh-Hdr-Fmd 复合物的复合冷冻电镜图。要点：● 样品以厌氧方式制备，用于cryo-EM分析。对Fdh-Hdr-Fmd (图1B)的二聚体进行成像和初始图像处理后，得到了与温石型支原体Mvh-Hdr晶体结构相似的二维结构。具有C2对称性的三维(3D)细化步骤提供了HdrABC二聚体核心 (图2)。● 另一方面，本文还模拟了最丰富的异构体：FdhA3和FdhB3。二聚体Fdh-Hdr-Fmd结构揭示了FdhAB和HdrABC通过MvhD连接的方式类似于温石型营养分枝杆菌的Mvh-Hdr，并且多聚铁氧还蛋白FmdF还桥接了HdrABC和FmdABCDG(图2)。▲图 3. 本文提出的 Fdh-Hdr-Fmd 复合物中的电子转移途径。要点：对二聚体和六聚体Fdh-Hdr-Fmd复合物的对称全局细化效应导致HdrABC核心的密度变高，但包含HdrA的N-末端结构域和C-末端结构域以及MvhD、FdhA和FdhB的亚复合物的密度变得十分不确定，本文称之为“移动臂”（mobile arm）。分类学给出了二聚体和六聚体数据集中的两种分辨良好的构象状态，相差约40°，产生了高达3.3 nm的位移(图3B和C)。图3D到F中总结了本文所提出的电子转移途径。在状态1中，来自甲酸盐或F420H2(在相关的Mvh-Hdr复合物中是H2)的电子通过电子中继移动到[2Fe-2S]团簇MD中，并从那里转移到HdrA的分叉FAD‘(图3D)。结果显示，MD、FAD‘和HDRA’之间的距离太远，不利于直接电子转移。此外，黄素的交叉电位需要在还原方向上绕过高能自由基态的机制。随着状态2的转变，一个弱还原电子可以从完全还原的FAD‘通过HA4’转移到Hdr位(HB1和HB2)，而来自FBEB的一个强还原电子可以从FAD‘转移到HA3，它起到电子穿梭的作用(图3E)。当配合物返回到状态1时，HA3将一个电子转移到HdrA插入的铁还蛋白结构域的HA5‘，该结构域在电子转移距离(9埃)内(图3B)。从HA5‘出发，电子通过HA6’传递到FmdF，并通过FmdG进一步传递到FmdBD中的钼掺杂之中(图3F)。 结语本文报告了电子分叉 Fdh-Hdr 的大量复合物(3 MDa)以及来自 M. Hungatei 的 CO2 还原 Fmd（FdhHdr-Fmd 六聚体）以及二聚体 Fdh-HdrFmd 的纯化和表征。Fdh-Hdr-Fmd 复合物通过使用来自甲酸盐或 F420 的还原形式 (F420H2) 的电子来催化 FBEB 反应，而无需外部铁氧还蛋白。复合物的低温电子显微镜 (cryo-EM) 表明氧化还原活性位点通过聚铁氧还蛋白亚基 FmdF 直接连接，以将 FBEB 与 CO2 固定相结合。HdrA 亚基内的构象变化为电子进出分叉黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 提供了构象门控途径（conformationally gated pathway）。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abg5550