当新的一种病毒袭来时，人类如何快速找到病毒入侵的“敲门砖”（病毒与细胞结合的受体），研发对症药物？人体内大约有2万到2万5千个蛋白质编码基因，哪一个又是研究者苦苦找寻的致病基因呢？基因编辑筛选技术，让我们能“大海捞针”，对候选基因进行广泛的无差别筛查。What：基因编辑筛选基于CRISPR/Cas9 系统，通过构建sgRNA 文库同时对多个细胞的不同基因进行编辑，辅助以特定的筛选方案，通过 NGS 测序和生信分析的手段，筛选出符合条件的候选基因。基因编辑筛选因快捷有效，目前在制药实验室逐步成为药物发现和开发的基本工具。图1：CRISPR-SCREEN 全流程总览How：基因编辑筛选典型CRISPR筛选的实验设计包括四个主要要素：生物模型;CRISPR库设计;细胞株筛选;检测分析在这里，我们主要探讨CRISPR库设计、细胞株筛选和检测。CRISPR库设计1）文库文库的形式主要有两种：混合文库和阵列文库。常用的是混合文库。混合文库是用计算机设计待筛选sgRNA文库并富集阳性克隆，随后转至宿主细胞以引入各种基因突变，最终通过高通量测序等方法获得结果；阵列文库将单个或数个sgRNA列于多孔板中进行处理，每孔中的基因编辑序列已知；文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。我们有两种筛选策略，全基因组筛选（包括所有基因，但对每个单个基因的敏感性相对较低）和具有高覆盖率的靶向筛选（专注于特定的候选基因或基因集，从而实现对这些基因的更高检测灵敏度）。图2：混合文库筛选与阵列文库筛选2）慢病毒载体的构建及感染宿主细胞图3：慢病毒包装将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现针对不同sgRNA相对应基因的功能筛选。那我们需要养多少细胞呢？通常用低于 30% 的MOI（multiplicity of infection，感染复数）来尝试确保一个细胞感染不超过一种 CRISPR 靶向序列。每个靶向序列必须感染至少 500 个细胞，以确保在检测灵敏度范围内获得结果。因此，对于包含 100,000 个靶向序列的 CRISPR 文库，建议至少使用1.67 x 108（10的8次方） 个细胞。这么多细胞的培养与后续筛选，纯靠人力是非常困难的。细胞株筛选靶基因筛选根据研究目的不同，有两种方法使用文库进行靶基因筛选：阳性筛选，通过随机诱变收集具有生长优势的群体。可以检测特定条件下生存的细胞，如药物治疗，而且可以很容易地阐明耐药机制。图4：阳性筛选阴性筛选，可以确定特定条件下生存的必须基因，如果一个细胞携带了靶向生存必须基因的gRNA，那么敲除后的细胞不能存活。可以有效地检测死亡或者缓慢生长的细胞，而且可以识别生存必须基因，这可能成为分子靶向药物的有效候选者。另外，阴性选择可以应用于合成致死性相互作用，其中两个基因的同时变化会导致生存力丧失，但是任一基因变化不影响生存力。这一机制对于确定分子靶向药的最佳组合具有重要意义。图5：阴性筛选感染后的细胞培养用靶向序列的病毒文库和所需的 Cas 酶处理细胞后，细胞必须孵育几天。这使细胞有时间发展表型 CRISPR 介导的变化——在许多实验中，这意味着细胞要么生长要么死亡。然后，如果特定实验需要，则进行药物或其他治疗。产品推荐汇像高通量细胞株筛选自动化系统可实现不同类型细胞自动化培养、自动计数、自动成像等功能。全自动化完成高通量的细胞铺板、细胞培养、汇合度测定、定时补加培养基、目标细胞株的挑取和重排，兼容96、24、6孔细胞培养板，解放人力，快速精准地筛选到目的细胞株。图6：高通量细胞株自动化筛选性能特点能实现培养基的自动加注及培养基的自动更换自动成像，可以有效地记录细胞、组织或整个生物体中发现的动态过程高通量测序高质量的 sgRNA 文库构建是实验成功的关键因素，所以构建完成后，一定要保证文库通过质检并达到相应的质量标准。NGS质检是基因组编辑分析的金标准，但 NGS 的高耗时是 CRISPR筛选工作的巨大瓶颈。产品推荐汇像NGS二代测序和文库构建功能岛可自动化、流程标准地完成高通量的测序工作，用于检测文库的覆盖度和均一性。覆盖度越接近 100%，均一性越接近 1，则代表文库的质量越高。实验步骤1 从所选的细胞亚群中提取基因组DNA，DNA模板应足量以保证文库的丰度2 对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，高通量测序以量化它们的相对丰度3 根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定基因型与表型之间的关系小结基因编辑筛选，一次能对多个基因进行基因干扰、敲除或者过表达等操作，然后在细胞层面进行功能表型检测，筛选有明显功能的基因或者突变位点，可有助于我们快速确定病毒攻击人类的靶点，从而加快药物研发的进程。图7：筛选抵抗新冠病毒感染的基因在2020年10月，美国的研究团队就曾通过全基因组的CRISPR筛选鉴定出抵抗新冠病毒感染的基因和药物靶标！随着检测软件、数据图像分析软件的不断优化更新，自动化系统的普及，这个技术会在更多领域得到充分应用。参考资料：https://news.bioon.com/article/6780205.htmlhttps://www.nature.com/articles/s43586-021-00093-4